Phụ lục 14.1

15.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ SỐỐNG CỦA VACXINVẮC XIN BCG

 

 

1. . Kiểm tra độ sống

1.1 Các vật liệu

            Dung dịch Sauton loãng 1/4 được sử dụng để pha loãng vacxinvắc xin BCG.

            Môi trường nuôi cấy: Lowenstein Jensen.

            VacxinVắc xin BCG mẫu thử và mẫu chuẩn

1.2 Hoàn nguyên và pha loãng vacxinvắc xin

VacxinVắc xin BCG  được xác định độ sống theo phương pháp  sau:

 

Hoàn nguyên ít nhất 5 mg vacxinvắc xin BCG vào 5 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 vô khuẩn để tạo hỗn dịch cơ bản chứa 1 mg vacxinvắc xin BCG/1ml. Sau khi hoàn nguyên, hỗn dịch này phải được giữ ở 4^oC trong thời gian tối thiểu 15 phút, sau đó pha theo công thức sau:

 

1.      1ml hỗn dịch cơ bản          +          99 ml dung dịch Sauton loãng 1/4       = 1/100         (I)

2.      1ml hỗn dịch pha loãng I   +          99 ml dung dịch Sauton loãng 1/4       = 1/10.000    (II)

3.      4 ml hỗn dịch pha loãng II +            4 ml dung dịch Sauton loãng 1/4       = 1/ 20.000   (III)

4.      2ml hỗn dịch pha loãng II +            6 ml dung dịch Sauton loãng 1/4       = 1/ 40.000   (IV)

5.      2ml hỗn dịch pha loãng II  +          14 ml đung dịch Sauton loãng 1/4       = 1/ 80.000   (V)

6.      2ml hỗn dịch pha loãng II  +          30 ml dung dịch Sauton loãng 1/4       = /160.000    (VI)

1.3 Nuôi cấy

Lắc đều hỗn dịch mỗi độ pha trong 20 giây, cấy vào môi trường Lowenstein - Jensen 0,1 ml/ống theo trình tự sau:

-          2 độ pha đầu: mMỗi độ pha loãng cấy lên 5 ống môi trường

-          Độ pha thứ 3 cấy lên 10 ống môi trường Lowenstein - Jensen.

Đối với vacxinvắc xin tươi (trước khi đông  khô): cCấy lên các ống môi trường Lowenstein - Jensen huyền dịch vacxinvắc xin BCG từ 3 độ pha loãng cuối IV, V,VI.

Đối với vacxinvắc xin BCG đông khô giữ ở 4 ^oC: cCấy huyền dịch vacxinvắc xin BCG từ 3 độ pha loãng III, IV, V.

Đối với vacxinvắc xin BCG đông khô ủ ở 37 ^oC: Ccấy huyền dịch vacxinvắc xin BCG từ 3 độ pha loãng II, III, IV.

Các ống môi trường đã được cấy huyền dịch vacxinvắc xin BCG ở các độ pha khác nhau như trên sẽ được láng đều, để khô bề mặt và ủ ở 37^oC /28 ngày.

1.4 Đếm độ sống

            Các ống môi trường được cấy huyền dịch BCG và ủ ở 37^oC sẽ được đưa ra đếm số khuẩn lạc mọc trên từng ống sau 21 ngày và 28 ngày.

1.5 Tính kết quả

Số đơn vị sống trong 1 ml vacxinvắc xin được tính theo 1 trong 4 công thức sau:

            Điều kiện xác định                                                  Công thức tính

 

[T1]

₁ : Số khuẩn lạc trung  bình mọc trên các ống môi trường Lowenstein - Jensen khi cấy huyền dịch BCG ở độ pha thứ 1

₂ : Số khuẩn lạc trung bình mọc trên các ống môi trường Lowenstein - Jensen khi cấy huyền dịch BCG ở độ pha thứ 2

₃ : Số khuẩn lạc trung bình mọc trên các ống môi trường Lowenstein - Jensen khi cấy huyền dịch BCG ở độ pha thứ 3

d   -  Độ pha loãng huyền dịch vacxinvắc xin BCG

v   -  Thể tích hỗn dịch cấy trên một ống môi trường Lowenstein - Jensen.

Hằng số w tương đương  với số lượng tối ưu khuẩn lạc có thể đếm được trên một ống môi trường Lowenstein - Jensen.

Kết quả độ sống của mỗi loạt vacxinvắc xin BCG có thể được tính theo chương trình phần mềm Whoprogram /BCG/Biofarma.

Tại nhà sản xuất, tiến hành kiểm tra độ sống ở tất cả các loạt vacxinvắc xin thành phẩm (bao gồm cả độ sống trước đông khô, sau đông khô và sau khi ủ ổn định nhiệt).

Những loạt vacxinvắc xin BCG có độ sống không đảm bảo với giới hạn cho phép ở lần kiểm tra thứ nhất phải nhắc lại thử nghiệm:

- Nếu thử nghiệm độ sống lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm có giá trị (valid test), phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường Lowenstein Jensen gấp đôi so với lần 1.

- Nếu thử nghiệm độ sống lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm không có giá trị (invalid test) thì chỉ cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường bằng lần 1.

Nếu lần thử nghiệm nhắc lại, độ sống vẫn không đạt thì phải huỷ bỏ loạt vacxinvắc xin BCG đó.

Kiểm tra độ sống của vacxinvắc xin BCG phải tiến hành song song với vacxinvắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống. Độ sống của vacxinvắc xin BCG mẫu chuẩn trong mỗi thử nghiệm phải ổn định và nằm trong giới hạn giá trị trung bình ± 2SD.

 

1.6 Tiêu chuẩn chấp thuận

Đối với vacxinvắc xin BCG phòng bệnh lao, giới hạn độ sống cho phép là từ 1 triệu đến 6 triệu đơn vị sống trong 1 mg vacxinvắc xin BCG (1.10⁶ – 6.10⁶ đvs/mg vaccxin BCG).

2. Kiểm tra tính ổn định nhiệt

Số đơn vị sống của vacxinvắc xin BCG sau khi ủ ở 37 ^oC/28 ngày phải đạt ít nhất là 20% so với mẫu ủ ở    4 ^oC /28 ngày .

2.1 Các vật liệu

            Dung dịch Sauton loãng 1/4 được sử dụng để pha loãng vacxinvắc xin BCG.

            Môi trường nuôi cấy: Lowenstein  Jensen.

            VacxinVắc xin BCG mẫu thử và mẫu chuẩn

            Trước khi kiểm tra tính ổn định nhiệt, vacxinvắc xin BCG đông khô mẫu thử phải được ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong 28 ngày như dưới đây:

            - Dạng 1mg/ống: ủ 10 ống ở 4 ^oC/28 ngày và 10 ống ở 37 ^oC/28 ngày.

            - Dạng 0,5mg/ống: ủ 20 ống ở 4 ^oC/28 ngày và 20 ống ở 37 ^oC/28 ngày.

 

 

 

2.2 Tiến hành

 

Kiểm tra  tính ổn định nhiệt của vacxinvắc xin BCG bằng  cách đếm độ sống của loạt vacxinvắc xin này sau khi ủ ở 4^oC và 37^oC/28 ngày. Quy trình đếm độ sống được thực hiện như ở Mmục 14.9.2. Tính tỷ lệ % số đơn vị sống BCG mọc ở 37 ^oC so với ở 4 ^oC.

 

                                    Số ĐVS/ mg vacxinvắc xin BCG ở 374 ^oC/28 ngày

          Tỷ lệ % ổn định nhiệt   ₌                                                                           x 100 (%)

                                    Số ĐVS/ mg vacxinvắc xin BCG ở 37 4 ^oC/28 ngày

 

ĐVS: đơn vị sống

Những loạt vacxinvắc xin BCG có tỷ lệ % ổn định nhiệt không đạt yêu cầu ở lần kiểm tra thứ nhất phải nhắc lại thử nghiệm:

- Nếu thử nghiệm tỷ lệ % ổn định nhiệt lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm có giá trị (valid test), phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường Lowenstein Jensen gấp đôi so với lần 1.

- Nếu thử nghiệm tỷ lệ % ổn định nhiệt lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm không có giá trị (invalid test) thì chỉ cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường bằng lần 1.

Nếu lần thử nghiệm nhắc lại, tỷ lệ % ổn định nhiệt vẫn không đạt thì phải huỷ bỏ loạt vacxinvắc xin BCG đó.

Kiểm tra tỷ lệ % ổn định nhiệt của vacxinvắc xin BCG phải tiến hành song song với vacxinvắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống. Độ sống của vacxinvắc xin BCG mẫu chuẩn trong mỗi thử nghiệm phải ổn định và nằm trong giới hạn giá trị trung bình ± 2SD.

 

2.3 Tiêu chuẩn chấp thuận

Tỷ lệ % số đơn vị sống BCG mọc ở 37 ^oC so với ở 4 ^oC phải không được thấp hơn 20 %.